TDP2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403902-ACT

Humanes TDP2 (Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterase 2) ist ein DNA-Reparaturenzyme, das 5′-Phosphotyrosyl-Addukte entfernt, die durch abortive Topoisomerase‑II‑Aktivität entstehen, und dadurch nach der Bildung von Doppelstrangbrüchen wieder ligierbare DNA-Enden herstellt. Diese Aktivität unterstützt die Genomstabilität und das Zellüberleben nach Replikationsstress und genotoxischer Exposition und wirkt innerhalb des umfassenderen Netzwerks der Doppelstrangbruchreparatur, koordiniert mit dem nicht-homologen End-Joining (NHEJ) und verwandten Faktoren der Endverarbeitung. TDP2 trägt außerdem zur Replikation von RNA-Viren bei, über Funktionen, die in einigen viralen Systemen mit der Abspaltung von VPg zusammenhängen, was seine Relevanz für Wirt–Pathogen-Interaktionen unterstreicht. Eine veränderte TDP2-Funktion wurde mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und Syndromen mit DNA-Reparaturdefizit in Verbindung gebracht und macht TDP2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der Genomerhaltung.

TDP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TDP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TDP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TDP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TDP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TDP2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TDP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TDP2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TDP2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TDP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.