TC-PTP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403071-ACT

Il gene umano PTPN2 codifica la fosfatasi tirosinica delle cellule T (TC-PTP), una PTP non recettoriale che defosforila intermedi di segnalazione per limitare le risposte a citochine e fattori di crescita. TC-PTP è un importante regolatore negativo della segnalazione JAK/STAT, modulando la fosforilazione dei membri della famiglia STAT e delle chinasi associate ai recettori, così da definire programmi trascrizionali che controllano l’omeostasi immunitaria, la proliferazione e le risposte allo stress cellulare. Attraverso il cross-talk con vie a valle delle tirosin-chinasi recettoriali e con segnali infiammatori, PTPN2 contribuisce a calibrare le soglie di attivazione e l’inibizione tramite feedback. Studi genetici e funzionali collegano alterazioni dell’attività o dell’espressione di PTPN2 a una segnalazione infiammatoria deregolata e alla suscettibilità a fenotipi immunomediati e metabolici, a sostegno della sua ampia rilevanza nella ricerca sui meccanismi di malattia.

TC-PTP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTPN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TC-PTP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTPN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTPN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TC-PTP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTPN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TC-PTP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TC-PTP nelle cellule tumorali con espressione di PTPN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.