TBX18 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401564-ACT

TBX18 kodiert einen Transkriptionsfaktor der T‑Box‑Familie, der durch die Regulation von Programmen der Linienfestlegung und der mesenchymalen Differenzierung die embryonale Musterbildung und Organogenese steuert. In der menschlichen Entwicklung ist TBX18 besonders mit der urogenitalen und muskuloskelettalen Morphogenese verbunden und trägt durch transkriptionelle Kontrolle entwicklungsrelevanter Gennetzwerke zur Ausbildung des kardialen Reizleitungssystems bei. Seine Aktivität überschneidet sich mit Signalprozessen, die Gewebegrenzen und Zellschicksalsentscheidungen prägen, darunter Signalwege, die durch WNT-, BMP- und FGF-Signale beeinflusst werden. Eine fehlregulierte TBX18-Expression oder -Funktion wurde mit angeborenen Entwicklungsanomalien in Verbindung gebracht, was TBX18 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung transkriptioneller Schaltkreise macht, die der Organentwicklung und krankheitsrelevanten Phänotypen zugrunde liegen.

TBX18 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TBX18-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TBX18 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TBX18-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TBX18-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TBX18-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TBX18-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TBX18-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TBX18-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TBX18-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.