TACE/ADAM17 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400827-ACT

ADAM17, auch bekannt als TACE, ist eine membranverankerte Metalloprotease, die das Abspalten (Shedding) der extrazellulären Domäne verschiedenster Substrate katalysiert, darunter TNF-α, EGFR-Liganden (wie Amphiregulin und TGF-α) sowie mehrere Adhäsionsmoleküle. Durch regulierte Proteolyse an der Zelloberfläche verknüpft TACE/ADAM17 entzündliche Signalwege mit wachstumsfaktorabhängigen Pfaden, darunter EGFR–MAPK/ERK und NF-κB, und beeinflusst so Zytokinfreisetzung, Rezeptoraktivierung und Gewebeumbau. Eine fehlregulierte ADAM17-Aktivität wurde mit chronischen Entzündungen und krebsassoziierten Signalnetzwerken in Verbindung gebracht und wird umfassend im Hinblick auf ihre Rolle in der Kommunikation von Immunzellen, der epithelialen Homöostase und dem Crosstalk im Mikromilieu untersucht.

TACE/ADAM17 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ADAM17-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TACE/ADAM17 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ADAM17-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ADAM17-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TACE/ADAM17-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ADAM17-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TACE/ADAM17-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TACE/ADAM17-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ADAM17-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.