Plasmide CRISPR d'Activation (h) SV2C: sc-402877-ACT

La glycoprotéine 2C des vésicules synaptiques (SV2C) est une protéine membranaire multipasse localisée dans les vésicules synaptiques et des compartiments sécrétoires apparentés, où elle contribue à la régulation du trafic vésiculaire, de l’amorçage et de la libération de neurotransmetteurs couplée à la stimulation. Dans les neurones, les protéines de la famille SV2 interagissent avec la machinerie centrale de l’exocytose et modulent le cycle des vésicules synaptiques ainsi que l’efficacité de la neurotransmission, avec un impact sur la signalisation à l’échelle des circuits. Chez l’humain, SV2C est enrichie dans les voies catécholaminergiques et a été associée au fonctionnement des synapses dopaminergiques, ce qui la rend pertinente pour l’étude de la vulnérabilité neuronale et du dysfonctionnement synaptique. Des altérations de l’expression ou de l’activité de SV2C ont été associées à des phénotypes neurodégénératifs et neuropsychiatriques dans des jeux de données génétiques et fonctionnels, ce qui étaye son utilisation comme nœud mécanistique dans la recherche en biologie synaptique.

SV2C Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SV2C sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SV2C Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SV2C dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SV2C, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SV2C. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SV2C natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SV2C au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SV2C dans les cellules tumorales présentant une expression de SV2C silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.