STAMP2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-431182-ACT

Mouse Steap4 kodiert STAMP2, eine Metalloreduktase mit sechs Transmembrandomänen, die die zelluläre Redoxkontrolle unterstützt, indem sie die Reduktion von dreiwertigem Eisen (Fe³⁺) und zweiwertigem Kupfer (Cu²⁺) erleichtert und metallabhängige Signalprozesse koordiniert. STAMP2 wird durch inflammatorische und metabolische Signale induziert und mit Signalwegen in Verbindung gebracht, die die Adipozytenfunktion, die Insulinempfindlichkeit und zytokinvermittelte Stressantworten regulieren. In Immun- und Stoffwechselgeweben beeinflusst STAMP2 das Gleichgewicht reaktiver Sauerstoffspezies sowie die Homöostase des endoplasmatischen Retikulums – Prozesse, die die Aktivierung von Makrophagen und den Umbau des Fettgewebes prägen. Eine Fehlregulation der Steap4-Expression wurde mit Entzündungszuständen und metabolischer Dysfunktion assoziiert, wodurch sich Steap4 als nützlicher Knotenpunkt zur Untersuchung des immunmetabolischen Crosstalks in Mausmodellen eignet.

STAMP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Steap4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

STAMP2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Steap4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Steap4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen STAMP2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Steap4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von STAMP2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des STAMP2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Steap4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.