SRP54 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403655-ACT

SRP54 kodiert die 54-kDa-Untereinheit des Signal Recognition Particle (SRP), eines zentralen Ribonukleoprotein-Komplexes, der N-terminale Signalpeptide erkennt und translierende Ribosomen an die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) koppelt. SRP54 fungiert als GTPase, die das kotranslationale Targeting durch die Interaktion mit dem SRP-Rezeptor und die nachfolgende Einbindung des SEC61-Translokons koordiniert und damit Sekretion sowie die Biogenese von Membranproteinen unterstützt. Durch die Steuerung des ER-Imports und der Proteostase beeinflusst SRP54 Signalwege, die mit ER-Stressantworten und der Homöostase des sekretorischen Weges verknüpft sind. Eine Störung oder Fehlregulation von SRP54 wurde mit krankheitsrelevanten Defekten in der Proteinadressierung und mit zellulären Stressphänotypen in Zusammenhang gebracht, einschließlich hämatologischer und immunologischer Funktionsstörungen, wie sie in humangenetischen Studien beschrieben wurden.

SRP54 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SRP54-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SRP54 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SRP54-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SRP54-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SRP54-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SRP54-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SRP54-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SRP54-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SRP54-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.