SQSTM1/p62 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400099-ACT

SQSTM1 kodiert Sequestosom 1 (p62), ein multifunktionales Adapterprotein, das ubiquitinierte Fracht über die Bindung an LC3 mit der selektiven Autophagie koppelt und über Interaktionen mit dem Ubiquitin-Proteasom-System zur Koordination der Proteostase beiträgt. p62 ist ein Signal-Knotenpunkt in Stressantwort-Signalwegen, darunter die KEAP1–NRF2-abhängige antioxidative Signalgebung und die Aktivierung von NF-κB, und wirkt an der Regulation von Apoptose, Entzündung und metabolischer Homöostase mit. Eine veränderte Expression oder Aggregation von SQSTM1/p62 wird mit einem gestörten autophagischen Flux und proteotoxischem Stress in Verbindung gebracht – Merkmale, die bei Neurodegeneration und weiteren Erkrankungen mit chronischem zellulärem Stress beobachtet werden. Als Gerüstprotein, das Abbauprozesse und Signalgebung integriert, ist SQSTM1 breit untersucht, unter anderem hinsichtlich seiner Rolle bei der Bildung von Einschlusskörperchen, der mitochondrialen Qualitätskontrolle und der Regulation der angeborenen Immunantwort.

SQSTM1/p62 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SQSTM1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SQSTM1/p62 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SQSTM1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SQSTM1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SQSTM1/p62-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SQSTM1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SQSTM1/p62-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SQSTM1/p62-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SQSTM1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.