SPOP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401290-ACT

O SPOP humano codifica a proteína POZ do tipo speckle, um adaptador de complexos de ligase E3 de ubiquitina baseados em CUL3 que reconhece proteínas substrato por meio do seu domínio MATH e facilita a sua ubiquitinação e degradação pelo proteassoma. Ao regular a estabilidade de reguladores-chave de sinalização e de transcrição, o SPOP influencia a homeostase de proteínas nucleares, as respostas a danos no DNA e programas associados ao ciclo celular. Alterações na função ou na expressão do SPOP têm sido associadas à desregulação da proteostase e do controle transcricional em múltiplos contextos de doença, sustentando seu uso como um nó mecanístico para o estudo de redes de sinalização dependentes de ubiquitina. Essas características tornam o SPOP um alvo útil para investigar a reprogramação de vias impulsionada por mudanças na seleção de substratos e na degradação mediadas por ligases de ubiquitina.

SPOP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPOP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SPOP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPOP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPOP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SPOP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPOP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SPOP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SPOP em células tumorais com expressão de SPOP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.