SPOP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401290-ACT

Humanes SPOP kodiert das speckle-type POZ protein, einen Adapter für CUL3-basierte E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexe, der Substratproteine über seine MATH-Domäne erkennt und deren Ubiquitinierung sowie proteasomalen Abbau erleichtert. Durch die Regulation der Stabilität zentraler Signal- und transkriptioneller Regulatoren beeinflusst SPOP die nukleäre Proteinhomöostase, DNA-Schadensantworten und zellzyklusassoziierte Programme. Eine veränderte SPOP-Funktion oder -Expression wurde in mehreren Krankheitskontexten mit einer dysregulierten Proteostase und Transkriptionskontrolle in Verbindung gebracht, was seine Nutzung als mechanistischen Knotenpunkt zur Untersuchung ubiquitinabhängiger Signalnetzwerke unterstützt. Diese Eigenschaften machen SPOP zu einem nützlichen Ziel, um Pathway-Rewiring zu untersuchen, das durch Veränderungen in der Substratauswahl und dem Turnover von Ubiquitin-Ligasen getrieben wird.

SPOP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPOP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SPOP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPOP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPOP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SPOP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPOP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SPOP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SPOP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPOP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.