spectrin α I Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403563-ACT

O SPTA1 codifica a espectrina αI, um componente central do esqueleto da membrana do eritrócito que forma heterotetrâmeros com a β-espectrina para criar uma rede flexível que sustenta a forma, a deformabilidade e a estabilidade mecânica das hemácias. Esse arcabouço acopla-se a complexos juncionais de actina e se ancora a proteínas de membrana por meio de interações com adaptadores, integrando a organização do citoesqueleto com a integridade da membrana sob estresse de cisalhamento. Alterações na montagem da espectrina ou na conectividade entre membrana e esqueleto comprometem a resiliência dos eritrócitos e estão implicadas em doenças hemolíticas hereditárias, incluindo esferocitose hereditária e eliptocitose hereditária. Como regulador estrutural, o SPTA1 também é estudado em vias que governam a dinâmica do citoesqueleto, o tráfego de membranas e as respostas biomecânicas.

spectrin α I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPTA1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

spectrin α I O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPTA1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPTA1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de spectrin α I. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPTA1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de spectrin α I no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via spectrin α I em células tumorais com expressão de SPTA1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.