SP-lyase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402278-ACT

Das humane SGPL1 kodiert die Sphingosin-1-phosphat-Lyase (SP-Lyase), ein mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziiertes Enzym, das Sphingosin-1-phosphat (S1P) irreversibel zu Phosphoethanolamin und einem langkettigen Aldehyd abbaut und damit die S1P-Signalübertragung beendet. Durch die Kontrolle des Gleichgewichts zwischen S1P und Ceramid/Sphingosin reguliert SGPL1 die Sphingolipid-Homöostase und beeinflusst Signalwege, die mit Zellüberleben, entzündlicher Signalgebung und lipidvermittelten Stressantworten verknüpft sind. Die SGPL1-Aktivität wirkt sich über die Modulation von S1P-Gradienten und rezeptorabhängiger Signalgebung auf das Trafficking von Immunzellen und die Gefäßbiologie aus. Eine veränderte SGPL1-Funktion und eine gestörte Sphingolipid-Metabolisierung wurden mit angeborenen Multisystemerkrankungen sowie breiteren Phänotypen in Verbindung gebracht, die Steroidogenese, Neuroentwicklung und Nierenfunktion betreffen, was SGPL1 zu einem wichtigen Ziel für mechanistische Studien der Lipidsignalgebung macht.

SP-lyase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SGPL1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SP-lyase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SGPL1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SGPL1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SP-lyase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SGPL1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SP-lyase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SP-lyase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SGPL1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.