SNX27 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403237-ACT

SNX27 (sorting nexin 27) è un adattatore endosomiale contenente un dominio PX che collega il riconoscimento dei fosfoinositidi di membrana al riciclo dei cargo, principalmente tramite l’interazione del suo dominio PDZ con i motivi di legame per PDZ presenti su proteine transmembrana. Associandosi ai complessi retromer e WASH, SNX27 contribuisce a coordinare il traffico dall’endosoma alla membrana plasmatica e la tubulazione dipendente dall’actina, modulando la disponibilità dei recettori e la segnalazione a valle. Questi processi influenzano l’omeostasi dei recettori sinaptici, il riciclo dei trasportatori di nutrienti e il mantenimento della polarità epiteliale, collegando SNX27 a vie che controllano l’ampiezza della segnalazione cellulare e la proteostasi di membrana. Alterazioni dell’espressione o della funzione di SNX27 sono state implicate in fenotipi neurosviluppo‑ e neurodegenerativi e in un traffico recettoriale deregolato osservato in diversi contesti cellulari rilevanti per la malattia.

SNX27 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SNX27 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SNX27 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SNX27 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SNX27, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SNX27. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SNX27 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SNX27 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SNX27 nelle cellule tumorali con espressione di SNX27 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.