Smurf1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401196-ACT

SMURF1 kodiert Smurf1, eine E3-Ubiquitin-Ligase mit HECT-Domäne, die den Proteinumsatz in zentralen Signalnetzwerken reguliert, darunter die TGF-β/BMP-SMAD-Signalwege, WNT/planare Zellpolarität sowie das Zytoskelett-Remodeling über die RhoA-Signalgebung. Durch die Katalyse der Ubiquitinierung von Komponenten dieser Signalwege beeinflusst Smurf1 die epithelial-mesenchymale Transition, Zellmigration und osteogene Differenzierung. Eine veränderte SMURF1-Aktivität wurde mit einer Fehlregulation von Wachstumsfaktor-Signalwegen und aberranten Gewebeumbauprozessen in Verbindung gebracht, die in der Krebsbiologie, bei Fibrose und in der Skelett-Homöostase eine Rolle spielen. Diese Funktionen machen SMURF1 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien zur ubiquitinvermittelten Proteostase und zum Signalweg-Crosstalk.

Smurf1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SMURF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Smurf1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SMURF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SMURF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Smurf1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SMURF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Smurf1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Smurf1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SMURF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.