Plásmido CRISPR de Activación (h) SMG8: sc-408902-ACT

SMG8 codifica un componente central del complejo SMG1C, que regula la degradación de ARNm mediada por codones sin sentido (NMD), una vía conservada de vigilancia del ARN que detecta y degrada transcritos que contienen codones de terminación prematuros. Al modular la actividad quinasa de SMG1 y coordinar la dinámica de fosforilación de UPF1, SMG8 ayuda a acoplar la terminación de la traducción con la remodelación de los mRNP y la degradación dirigida del ARNm. Mediante estos mecanismos, SMG8 contribuye al control de calidad del transcriptoma, la proteostasis y programas de expresión génica sensibles al estrés. La NMD desregulada y las alteraciones del metabolismo del ARN vinculadas a SMG8 se han asociado con cambios en la homeostasis celular y se estudian en contextos que incluyen fenotipos del neurodesarrollo y modificaciones de la expresión génica relevantes para el cáncer.

SMG8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SMG8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SMG8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SMG8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SMG8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SMG8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SMG8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SMG8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SMG8 en células tumorales con expresión de SMG8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.