Plasmide CRISPR d'Activation (h) SMG5: sc-406989-ACT

SMG5 code un composant central conservé de la machinerie de dégradation des ARNm médiée par les codons non-sens (NMD), qui préserve l’intégrité du transcriptome en favorisant la reconnaissance et l’élimination des ARNm aberrants. SMG5 s’associe à UPF1 phosphorylée et coopère avec SMG6 et SMG7 pour coordonner la déphosphorylation d’UPF1 via PP2A ainsi que les étapes de dégradation en aval, reliant ainsi la surveillance à la terminaison de la traduction et au contrôle qualité des ARN. Via la NMD, SMG5 influence des programmes d’expression génique, les réponses au stress et la protéostasie en limitant l’accumulation de transcrits contenant des codons stop prématurés et de certains isoformes physiologiques d’ARNm. Une NMD dérégulée a été impliquée dans divers contextes pertinents pour les maladies, notamment le remodelage du transcriptome associé au cancer et des troubles génétiques dus à des variants non-sens, ce qui fait de SMG5 un nœud utile pour des études mécanistiques en biologie des ARN.

SMG5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SMG5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SMG5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SMG5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SMG5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SMG5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SMG5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SMG5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SMG5 dans les cellules tumorales présentant une expression de SMG5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.