SmcY CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403217-ACT

KDM5D kodiert die Y‑chromosomal verknüpfte Lysin-Demethylase SmcY (JARID1D), einen Chromatinregulator, der H3K4me2/3-Markierungen entfernt, um Transkriptionsprogramme zu modulieren. Durch seine Rolle in der epigenetischen Kontrolle trägt SmcY zur Aufrechterhaltung der Zellidentität, zur Regulation der Expression proliferationsassoziierter Gene sowie zur Koordination des Chromatinzustands mit DNA‑abhängigen Prozessen wie Replikation und Reparatur bei. Eine veränderte Aktivität der KDM5‑Familie wurde mit fehlregulierten Transkriptionsnetzwerken in Krebs- und Entwicklungskontexten in Verbindung gebracht, und KDM5D selbst wird häufig im Zusammenhang mit geschlechtsspezifischer Biologie und dem Verlust des Y‑Chromosoms in somatischen Geweben untersucht. Diese Eigenschaften machen KDM5D zu einem nützlichen Modell, um zu untersuchen, wie Histon-Demethylierung Signalweg-Outputs und zelluläre Phänotypen prägt.

SmcY Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KDM5D-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SmcY Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KDM5D-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KDM5D-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SmcY-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KDM5D-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SmcY-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SmcY-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KDM5D-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.