Smchd1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-428851-ACT

Smchd1 (structural maintenance of chromosomes flexible hinge domain containing 1) ist ein epigenetischer Regulator, der in Mauszellen die höherstufige Chromatinorganisation und die langfristige Genstilllegung unterstützt. Das SMCHD1-Protein trägt zur stabilen Repression bestimmter genomischer Regionen bei, darunter Elemente, die mit der X-Chromosom-Inaktivierung und anderen kontextabhängigen Silencing-Programmen assoziiert sind, und verbindet es damit mit der Transkriptionskontrolle und der Chromatinarchitektur. Über Effekte auf die DNA-Methylierung, die Landschaft von Histonmodifikationen und die Chromatinkompaktion beeinflusst Smchd1 die entwicklungsbezogene Genregulation und linienspezifische Expressionszustände. Eine Fehlregulation der SMCHD1-abhängigen Repression wurde mit veränderten Chromatinzuständen in Verbindung gebracht, die für Entwicklungsphänotypen und Mechanismen neuromuskulärer Erkrankungen relevant sind, wodurch es ein nützliches Ziel für funktionelle Genomikstudien zur epigenetischen Kontrolle darstellt.

Smchd1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Smchd1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Smchd1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Smchd1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Smchd1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Smchd1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Smchd1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Smchd1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Smchd1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Smchd1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.