Plasmide CRISPR d'Activation (h) SMC1α: sc-402865-ACT

SMC1A code la protéine de maintenance structurelle des chromosomes 1α (SMC1α), un composant central du complexe cohésine, qui contrôle la cohésion des chromatides sœurs, la ségrégation des chromosomes et l’organisation de la chromatine à des niveaux supérieurs. Par l’extrusion de boucles d’ADN dépendante de la cohésine et sa coordination avec CTCF, SMC1α influence la régulation transcriptionnelle, le timing de la réplication de l’ADN et le maintien de la stabilité du génome. SMC1α participe également à la signalisation et à la réparation des dommages à l’ADN, en soutenant les réponses des points de contrôle face au stress réplicatif et aux cassures double brin. La dérégulation ou les mutations de SMC1A et des composants de la voie de la cohésine sont associées aux cohésinopathies et ont été impliquées dans l’instabilité génomique ainsi que dans des programmes d’expression génique altérés pertinents pour la biologie du cancer.

SMC1α Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SMC1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SMC1α Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SMC1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SMC1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SMC1α. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SMC1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SMC1α au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SMC1α dans les cellules tumorales présentant une expression de SMC1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.