Smad3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400069-ACT

SMAD3 kodiert Smad3, ein rezeptorreguliertes SMAD-Protein, das kanonische Signale der TGF‑β‑Superfamilie von aktivierten Typ‑I‑Rezeptoren in den Zellkern weiterleitet. Nach der Phosphorylierung bildet Smad3 Komplexe mit SMAD4 und wirkt mit linienspezifischen Transkriptionsfaktoren zusammen, um Gene zu steuern, die an der Umgestaltung der extrazellulären Matrix, der epithelial‑mesenchymalen Transition, der Immunregulation und der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt sind. Über dieses transkriptionelle Programm beeinflusst Smad3 Prozesse wie Fibrose, Entzündung und Differenzierung in unterschiedlichen Gewebekontexten. Eine dysregulierte SMAD3‑Signalübertragung wurde mit erblichen Bindegewebs‑ und Gefäßphänotypen sowie mit aberranten, TGF‑β‑getriebenen Programmen in Krebs‑ und Modellen chronisch‑entzündlicher Erkrankungen in Verbindung gebracht.

Smad3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SMAD3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Smad3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SMAD3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SMAD3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Smad3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SMAD3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Smad3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Smad3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SMAD3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.