Plásmido CRISPR de Activación (h) Sm B/B′: sc-404311-ACT

SNRPB codifica la proteína central del espliceosoma Sm B/B′, un componente canónico del anillo Sm que se ensambla sobre pequeños ARN nucleares ricos en uridina para formar las snRNP U1, U2, U4/U6 y U5. A través de estos complejos, Sm B/B′ contribuye al empalme del pre-ARNm, a la biogénesis del espliceosoma y a programas más amplios de procesamiento de ARN que determinan la diversidad de isoformas de transcritos y la homeostasis de la expresión génica. La alteración de la fidelidad del empalme asociada a SNRPB puede influir en vías que regulan el control del ciclo celular, las respuestas al daño del ADN y las salidas transcripcionales adaptativas al estrés. Los componentes del espliceosoma desregulados, incluidas las proteínas Sm, se investigan con frecuencia en contextos de firmas de empalme aberrantes y desequilibrio de la proteostasis observados en múltiples modelos celulares relevantes para enfermedades.

Sm B/B′ El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SNRPB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Sm B/B′ El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SNRPB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SNRPB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Sm B/B′. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SNRPB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Sm B/B′ en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Sm B/B′ en células tumorales con expresión de SNRPB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.