SLK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406490-ACT

Die humane SLK (STE20-like kinase) kodiert eine Serin/Threonin-Kinase, die an der Umgestaltung des Zytoskeletts, dem Turnover fokaler Adhäsionen sowie der Regulation von Zellmotilität und Zellpolarität beteiligt ist. SLK wirkt in Signalnetzwerken mit, die mit MAPK-ähnlichen Kinasekaskaden und stressresponsiven Signalwegen verknüpft sind und die Aktindynamik mit Zellzyklusprogression und Apoptose koordinieren. Über Effekte auf adhäsionsabhängige Signalübertragung und Gewebearchitektur wurde eine veränderte SLK-Aktivität mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Tumorzellinvasion, epitheliale Integrität und Entwicklungsanomalien relevant sind. SLK wird daher häufig in Modellen zu Migration, Morphogenese und Signalweg-Crosstalk untersucht, der mechanische Reize mit Transkriptionsprogrammen koppelt.

SLK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SLK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SLK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SLK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SLK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.