SLC12A8 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-431364-ACT

Slc12a8 kodiert SLC12A8, ein Mitglied der Solute-Carrier-12-(SLC12)-Familie kationen-gekoppelter Transporter, die Ionengradienten an der Membran reguliert und zur osmotischen Homöostase von Epithelien und Zellen beiträgt. Durch die Modulation gekoppelter Na⁺/K⁺/Cl⁻-Flüsse und der damit verbundenen elektrochemischen Triebkräfte kann SLC12A8 die Kontrolle des Zellvolumens, transepitheliale Transportprozesse sowie nachgeschaltete Signalwege beeinflussen, die mit metabolischen und stressresponsiven Pfaden verknüpft sind. Eine veränderte Aktivität von SLC12-Transportern ist häufig mit Störungen des Elektrolytgleichgewichts und der Gewebephysiologie assoziiert, wodurch Slc12a8 ein nützliches Ziel für die Untersuchung transporterabhängiger Mechanismen in normalen und krankheitsrelevanten Kontexten darstellt. In Mausmodellen kann die Regulation von Slc12a8 genutzt werden, um zu untersuchen, wie Ionentransport mit Barrierefunktion, Entzündung und metabolischer Anpassung zusammenwirkt.

SLC12A8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Slc12a8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SLC12A8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Slc12a8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Slc12a8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SLC12A8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Slc12a8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SLC12A8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SLC12A8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Slc12a8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.