Plasmide CRISPR d'Activation (h) SLBP: sc-403637-ACT

La protéine de liaison à la structure tige-boucle (Stem-Loop Binding Protein, SLBP) est un facteur conservé de liaison à l’ARN qui reconnaît la structure tige-boucle en 3′ des ARNm d’histones dépendants de la réplication, et coordonne leur maturation, leur export nucléaire, leur traduction et leur dégradation rapide à la fin de la phase S. En couplant l’approvisionnement en histones à la réplication de l’ADN, la SLBP soutient l’assemblage de la chromatine, la stabilité du génome et une progression ordonnée du cycle cellulaire, en s’intégrant aux points de contrôle de la phase S et aux voies de réponse aux dommages de l’ADN. Une activité de SLBP dérégulée peut perturber l’homéostasie des histones, entraînant un stress réplicatif, des modifications du paysage chromatinien et une instabilité transcriptionnelle. Par conséquent, la SLBP est fréquemment étudiée dans des contextes de biologie de la prolifération et de dérégulation du cycle cellulaire associée aux tumeurs, comme nœud mécanistique reliant la maturation des ARN au maintien de la chromatine.

SLBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLBP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SLBP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLBP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLBP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SLBP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLBP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SLBP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SLBP dans les cellules tumorales présentant une expression de SLBP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.