Skp2 p45 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400534-ACT

SKP2 kodiert das F-Box-Protein Skp2 p45, eine Substraterkennungs-Komponente des SCF-(SKP1–CUL1–F-box)-E3-Ubiquitin-Ligasekomplexes, der den proteasomalen Abbau zentraler Zellzyklusregulatoren steuert. Durch die Förderung der Ubiquitinierung von Zielproteinen wie CDKN1B/p27^Kip1 und weiteren wachstumshemmenden Proteinen unterstützt Skp2 den G1/S-Übergang, die Kompetenz zur DNA-Replikation sowie koordinierte Checkpoint-Antworten. Die SKP2-Aktivität ist mit PI3K–AKT-, RB–E2F- und TGF-β-assoziierten Signalprogrammen verknüpft, die Proliferation, Seneszenz und Stressadaptation prägen. Eine fehlregulierte SKP2-Expression oder -Funktion wurde in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten mit veränderter Zellzykluskontrolle und genomischer Instabilität in Verbindung gebracht, wodurch SKP2 einen häufigen Knotenpunkt für mechanistische Untersuchungen onkogener Signalwege und der Proteinhomöostase darstellt.

Skp2 p45 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SKP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Skp2 p45 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SKP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SKP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Skp2 p45-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SKP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Skp2 p45-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Skp2 p45-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SKP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.