SKI-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402595-ACT

MBTPS1 kodiert SKI-1/S1P, eine im Golgi lokalisierte, subtilisinähnliche Proprotein-Konvertase, die membrangebundene Transkriptionsfaktoren spaltet und so deren Aktivierung und Translokation in den Zellkern steuert. SKI-1 ist ein zentraler übergeordneter Regulator der Sterol- und Lipidhomöostase, indem es SREBPs prozessiert und dadurch Programme der Cholesterin- und Fettsäurebiosynthese sowie breitere metabolische Signalnetzwerke beeinflusst. Zudem ist es an ER–Golgi-Stressanpassungswegen beteiligt, indem es die Aktivierung von ATF6 und verwandten Proteostase-Antworten moduliert. Eine Fehlregulation der MBTPS1/SKI-1-Aktivität wurde mit erblichen Bindegewebs- und Skelettphänotypen sowie mit zellulären Zuständen mit verändertem Lipidstoffwechsel in Verbindung gebracht, was MBTPS1/SKI-1 für mechanistische Studien zu Metabolismus, Biologie des sekretorischen Weges und Stresssignalgebung relevant macht.

SKI-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MBTPS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SKI-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MBTPS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MBTPS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SKI-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MBTPS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SKI-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SKI-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MBTPS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.