Six6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405096-ACT

SIX6 kodiert den Homeobox-Transkriptionsfaktor Six6, einen nukleären DNA-bindenden Regulator, der für die embryonale Entwicklung von Auge und Vorderhirn sowie für die Aufrechterhaltung der Identität neuroretinaler Zellen essenziell ist. Six6 moduliert Genexpressionsprogramme, die die Proliferation von Vorläuferzellen, das Timing des Zellzyklus und die Festlegung von Zelllinien steuern, und ist dabei in entwicklungsbiologische Signalnetzwerke eingebunden, zu denen unter anderem WNT-, SHH- und BMP-Signale gehören. Veränderte SIX6-Dosierung oder regulatorische Variation wurde mit okulären Phänotypen wie Anomalien der Entwicklung des Sehnervenkopfes und der Netzhaut sowie mit einem genetisch erhöhten Risiko für glaukombezogene Merkmale in Verbindung gebracht, was seine Bedeutung für die Neuroentwicklung und die Biologie okulärer Erkrankungen unterstreicht. Als transkriptioneller Regulator wird Six6 häufig in Modellen der retinalen Differenzierung, neuronaler Schicksalsentscheidungen und der Architektur genregulatorischer Netzwerke untersucht.

Six6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SIX6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Six6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SIX6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SIX6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Six6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SIX6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Six6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Six6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SIX6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.