Six2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402975-ACT

SIX2 kodiert den Homeobox-Transkriptionsfaktor Six2, einen Entwicklungsregulator, der die Identität von Vorläuferzellen aufrechterhält und Programme zur Festlegung von Zelllinien steuert. In menschlichen Geweben beeinflussen von Six2 getriebene transkriptionelle Netzwerke die mesenchymale Differenzierung, epithel–mesenchymale Interaktionen und organogeneseassoziierte Signalwege, mit nachgelagerten Effekten auf das Timing des Zellzyklus und die Aufrechterhaltung des Chromatinzustands. Eine dysregulierte SIX2-Expression wurde mit veränderten Entwicklungs-Genprogrammen in Verbindung gebracht und in Zusammenhängen aberranter Proliferation und Differenzierung beschrieben, was SIX2 für mechanistische Studien zu Entwicklungsstörungen und onkogener transkriptioneller Umprogrammierung relevant macht. Als DNA-bindender Regulator wird Six2 häufig als Knotenpunkt genutzt, um Transkriptionskontrollschaltkreise und Zellschicksalsentscheidungen in Stamm- und Vorläuferzellmodellen zu untersuchen.

Six2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SIX2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Six2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SIX2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SIX2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Six2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SIX2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Six2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Six2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SIX2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.