SID-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407959-ACT

Humanes SIDT2 (SID-2) kodiert ein endolysosomales Membranprotein, das an intrazellulärem Nukleinsäuretransport und lysosomenassoziierten Homöostaseprozessen beteiligt ist. Berichtetete Funktionen bringen SID-2 mit endozytotischem Transport, lysosomaler Integrität und umfassenderen Proteostase-Netzwerken in Verbindung, die den Abbau von Makromolekülen und Stressantworten beeinflussen. Über diese Signal- und Transportwege wurde SIDT2 in Kontexten untersucht, in denen lysosomale Fehlfunktionen zu zellulären Phänotypen beitragen, darunter Modelle mit Relevanz für neurodegenerative und metabolische Erkrankungen. Die Modulation der SIDT2-Expression unterstützt mechanistische Studien zu endolysosomalem Transport, RNA-Handhabung und lysosomenabhängiger Signalübertragung.

SID-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SIDT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SID-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SIDT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SIDT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SID-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SIDT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SID-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SID-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SIDT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.