Plásmido CRISPR de Activación (h) Shrm: sc-403640-ACT

El SHROOM3 humano codifica Shrm, un regulador de la morfología celular asociado a la actina que actúa como andamio de la señalización de la quinasa Rho para promover la constricción apical y la remodelación del citoesqueleto. Shrm contribuye a la arquitectura del tejido epitelial, la polarización celular y los movimientos morfogenéticos coordinados durante el desarrollo al acoplar la contractilidad actomiosínica con la curvatura de la membrana. La alteración de la actividad de SHROOM3 se ha vinculado a defectos en la organización epitelial y en procesos del desarrollo, y la variación genética en SHROOM3 se asocia con rasgos relacionados con el riñón y con la susceptibilidad a enfermedades. Estas funciones convierten a SHROOM3 en un punto de partida útil para estudiar la dinámica del citoesqueleto, la mecanotransducción y la señalización dependiente de la polaridad en modelos celulares relevantes.

Shrm El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SHROOM3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Shrm El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SHROOM3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SHROOM3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Shrm. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SHROOM3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Shrm en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Shrm en células tumorales con expresión de SHROOM3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.