Shh CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400225-ACT

Das humane **SHH**-Gen kodiert **Sonic hedgehog (Shh)**, ein sezerniertes Morphogen, das über die Hedgehog-Signalkaskade die embryonale Musterbildung, Gewebepolarität sowie das Verhalten von Stamm- und Vorläuferzellen steuert. Shh bindet an **PTCH1** und hebt dadurch die Hemmung von **SMO** auf, was zur Aktivierung der **GLI**-Transkriptionsfaktoren und nachgeschalteter Programme führt, die Proliferation, Differenzierung und räumliche Organisation regulieren. In adulten Geweben trägt **SHH** zu epithelial-mesenchymalen Interaktionen und zur Aufrechterhaltung von Nischen bei; eine fehlregulierte Hedgehog-Signalgebung ist mit Entwicklungsstörungen und onkogenen Signalzusammenhängen assoziiert. Die Aktivität des SHH-Signalwegs wird häufig im Kontext der Neuralrohr- und Extremitätenentwicklung, der Organogenese sowie der signalabhängigen Transkriptionskontrolle untersucht.

Shh Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SHH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Shh Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SHH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SHH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Shh-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SHH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Shh-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Shh-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SHH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.