Sec8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405009-ACT

Das humane Gen **EXOC4** kodiert **Sec8**, eine Kernkomponente des oktameren **Exocyst-Komplexes**, der post-Golgi-sekretorische Vesikel vor der SNARE-abhängigen Membranfusion an die Plasmamembran andockt. Sec8 unterstützt polarisierte Exozytose, die Lieferung von Membranproteinen und die Koordination des Zytoskeletts und verknüpft so den Vesikeltransport mit Zellmigration, Neuritenauswuchs und Programmen der epithelialen Polarität. Über exocyst-abhängigen Transport beeinflusst EXOC4 Signalwege und die Verfügbarkeit von Rezeptoren an der Zelloberfläche, mit nachgelagerten Effekten auf die Reaktionsfähigkeit auf Wachstumsfaktoren und die Aufrechterhaltung von Zell-Zell-Kontakten. Eine Fehlregulation der Exocyst-Funktion, einschließlich veränderter EXOC4/Sec8-Aktivität, wurde mit Defekten in Sekretion und Polarität in Verbindung gebracht, die häufig im Kontext invasiven Verhaltens und anderer komplexer, krankheitsrelevanter zellulärer Phänotypen untersucht werden.

Sec8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EXOC4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Sec8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EXOC4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EXOC4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Sec8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EXOC4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Sec8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Sec8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EXOC4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.