SCUBE2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425305-ACT

Scube2 kodiert SCUBE2, ein sezerniertes, an der Zelloberfläche vorkommendes Glykoprotein mit EGF-ähnlichen Wiederholungen und einer CUB-Domäne, das als extrazelluläres Gerüst und Modulator der Signalübertragung fungiert. In Mausgeweben trägt SCUBE2 zur Entwicklungsmusterbildung und zur interzellulären Kommunikation bei, indem es die Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren und die Dynamik der Rezeptorsignalgebung beeinflusst; beschrieben sind unter anderem Zusammenhänge mit Signalwegen wie der Hedgehog-Signalgebung. Durch die Gestaltung von Ligand–Rezeptor-Interaktionen und extrazellulärmatrixassoziierten Prozessen kann SCUBE2 Zellschicksalsentscheidungen, Migration und epitheliale Organisation beeinflussen. Eine veränderte SCUBE2-Expression wurde mit fehlregulierten Signalprogrammen in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und Entwicklungsstörungen relevant sind, was seine Nutzung als mechanistischen Knotenpunkt in signalwegzentrierten Studien stützt.

SCUBE2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Scube2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SCUBE2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Scube2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Scube2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SCUBE2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Scube2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SCUBE2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SCUBE2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Scube2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.