SC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402459-ACT

Der polymerische Immunglobulinrezeptor (PIGR) kodiert die sekretorische Komponente (SC), einen transmembranen Rezeptor, der an der basolateralen Oberfläche von Epithelzellen dimeres IgA und pentameres IgM bindet und sie für die mukosale Sekretion durch das Epithel transportiert. Während der Transzytose wird SC proteolytisch abgespalten und bleibt mit sekretorischem IgA assoziiert, wodurch die Immunexklusion verstärkt und Antikörper in mukosalen Umgebungen vor Proteolyse geschützt werden. Die PIGR-Expression wird durch entzündliche und zytokingesteuerte Signalwege reguliert, darunter NF-κB- und JAK/STAT-Signalwege, und verknüpft so angeborene epitheliale Antworten mit der adaptiven mukosalen Immunität. Eine fehlregulierte PIGR/SC-Biologie wird im Kontext von Barrierefunktionsstörungen und chronischer Entzündung untersucht, mit Bedeutung für die Infektanfälligkeit und für Interaktionen mit dem epithelialen Tumormikromilieu.

SC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PIGR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PIGR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PIGR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PIGR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PIGR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.