Plásmido CRISPR de Activación (m) SAV1: sc-425662-ACT

Sav1 codifica la proteína 1 que contiene dominio WW de la familia Salvador (SAV1), un componente andamiaje de la vía de señalización Hippo que coopera con las quinasas MST1/2 y LATS para regular la actividad de YAP/TAZ y las salidas transcripcionales que controlan la proliferación, la apoptosis y el crecimiento tisular. En células de ratón, SAV1 favorece la inhibición por contacto y la homeostasis epitelial al coordinar el ensamblaje de complejos de quinasas y cascadas de fosforilación que restringen programas de expresión génica promotores del crecimiento. La desregulación de la señalización Hippo vinculada a SAV1 se asocia con alteraciones en el control del tamaño de los órganos, respuestas regenerativas aberrantes y fenotipos asociados a tumores en modelos experimentales, lo que convierte a Sav1 en un nodo útil para estudiar el control del crecimiento y la mecanotransducción. SAV1 también se conecta con la dinámica del citoesqueleto y la señalización en uniones celulares, proporcionando una vía para investigar cómo la polaridad celular y las señales mecánicas influyen en el estado transcripcional.

SAV1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Sav1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SAV1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Sav1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Sav1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SAV1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Sav1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SAV1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SAV1 en células tumorales con expresión de Sav1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.