Plasmide CRISPR d'Activation (h) RPGRIP1L: sc-404458-ACT

RPGRIP1L code une protéine de la zone de transition ciliaire qui sert de plateforme d’assemblage à des composants interagissant avec RPGR et contribue à établir la barrière de diffusion qui contrôle le trafic des protéines entrant dans le cil primaire et en sortant. Elle participe à l’organisation du centrosome/corps basal et soutient la voie Hedgehog ainsi que d’autres voies de signalisation dépendantes des cils, qui coordonnent la mise en place des patrons embryonnaires et l’homéostasie tissulaire. La perturbation de RPGRIP1L altère la ciliogenèse et la transduction du signal, reliant un défaut de « gating » ciliaire à des phénotypes développementaux pléiotropes. Des variations génétiques de RPGRIP1L ont été associées à des ciliopathies, notamment les troubles du spectre de Joubert et de Meckel, ce qui en fait un nœud pertinent pour étudier, dans des cellules humaines, les mécanismes pathogènes liés aux cils.

RPGRIP1L Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RPGRIP1L sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RPGRIP1L Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RPGRIP1L dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RPGRIP1L, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RPGRIP1L. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RPGRIP1L natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RPGRIP1L au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RPGRIP1L dans les cellules tumorales présentant une expression de RPGRIP1L silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.