RPB2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402591-ACT

POLR2B kodiert RPB2, die zweitgrößte katalytische Untereinheit der RNA-Polymerase II, die mRNA und viele nichtkodierende RNAs synthetisiert, die für die eukaryotische Genexpression essenziell sind. RPB2 trägt zur Öffnung des Promotors, zur Nukleotidinkorporation und zur Prozessivität der Transkription bei und koppelt die Transkription an kotranskriptionelle RNA-Prozessierung und die Chromatinregulation. Als Kernbestandteil der basalen Transkriptionsmaschinerie unterstützt POLR2B Signalwege, die den Zellzyklusfortschritt, die Differenzierung und Stressantworten steuern, indem es die globale Transkriptionsleistung kontrolliert. Eine Fehlregulation der RNA-Polymerase-II-Funktion und der transkriptionellen Homöostase ist für die Biologie proliferativer und neuroentwicklungsbezogener Erkrankungen breit relevant, da veränderte Genexpressionsprogramme einen zentralen Mechanismus darstellen.

POLR2B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLR2B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

POLR2B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLR2B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLR2B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen POLR2B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLR2B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von POLR2B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des POLR2B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLR2B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.