RPA194 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400816-ACT

POLR1A kodiert RPA194, die größte katalytische Untereinheit der RNA-Polymerase I, die im Nukleolus die Synthese ribosomaler RNA (47S-Prä-rRNA) antreibt – ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Ribosomenbiogenese und damit der Proteomkapazität. Die Funktion von RPA194 ist mit der Organisation des Nukleolus, der Kontrolle der rDNA-Transkription und zellulären Wachstumsprogrammen verknüpft und koppelt Nährstoff- und Stresssignale an die Translationsleistung. Eine Störung der Pol-I-Transkription kann nukleolären Stress auslösen und p53-abhängige sowie p53-unabhängige Überwachungswege aktivieren, wodurch die Regulation von POLR1A mit Genomstabilität und Zellzykluskontrolle in Verbindung steht. Abweichende Ribosomenbiogenese und veränderte Pol-I-Aktivität werden mit proliferativen Phänotypen und krankheitsrelevanten Zuständen assoziiert, in denen der Bedarf an Proteinsynthese und die nukleoläre Funktion umgestaltet werden.

RPA194 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLR1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RPA194 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLR1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLR1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RPA194-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLR1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RPA194-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RPA194-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLR1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.