Rock-2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422695-ACT

Mouse Rock2 kodiert die Rho-assoziierte, coiled-coil-haltige Proteinkinase 2 (ROCK2), eine Serin/Threonin-Kinase, die als zentraler Effektor von RhoA wirkt und die Aktomyosin-Kontraktilität, die Bildung von Stressfasern sowie die Dynamik fokaler Adhäsionen steuert. ROCK2 phosphoryliert Substrate wie MYPT1 und LIMK und reguliert dadurch die Aktivität der Myosin-Leichtkette sowie das cofilinabhängige Aktin-Remodelling, was Zellform, Polarität und Migration beeinflusst. Über diese zytoskelettalen Programme trägt Rock2 zu Prozessen wie Zytokinese, Neuritenauswuchs und dem Tonus der glatten Gefäßmuskulatur bei und wird häufig im Kontext von Fibrose, Entzündung, Neurodegeneration sowie krebsassoziierter Invasion und Metastasierung untersucht. Die Vernetzung dieses Signalwegs mit der Rho-GTPase-Signalgebung und der Mechanotransduktion macht Rock2 zu einem häufig genutzten Knotenpunkt, um zu untersuchen, wie zytoskelettale Spannung mit transkriptionellen und extrazellulären Matrix-Signalen zusammenwirkt.

Rock-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Rock2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rock-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Rock2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Rock2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rock-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Rock2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rock-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rock-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Rock2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.