RNF4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422689-ACT

Das Mausgen *Rnf4* kodiert RNF4, eine SUMO-gerichtete Ubiquitin-E3-Ligase, die poly-SUMOylierte Substrate über SUMO-interagierende Motive erkennt und deren Ubiquitinierung sowie proteasomalen Abbau fördert. RNF4 trägt dazu bei, SUMO-Signalgebung mit der ubiquitinabhängigen Proteinkontrolle zu koppeln, und beeinflusst durch die Modulation zentraler nukleärer Faktoren DNA-Schadensantworten, Replikationsstress und die Transkriptionsregulation. Indem RNF4 die Stabilität SUMO-modifizierter Proteine steuert, trägt es zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität und zum Fortschreiten des Zellzyklus bei – Prozesse, die bei onkogener Transformation häufig gestört sind. Eine Perturbation von *Rnf4* wird daher eingesetzt, um das Crosstalk zwischen SUMO- und Ubiquitin-Signalwegen, die nukleäre Proteostase sowie stressadaptive Signalnetzwerke in Säugerzellen zu untersuchen.

RNF4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Rnf4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RNF4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Rnf4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Rnf4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RNF4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Rnf4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RNF4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RNF4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Rnf4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.