Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNase HII-A: sc-405715-ACT

RNASEH2A code la sous-unité catalytique de la ribonucléase H2, RNase HII-A, une endonucléase qui reconnaît et élimine les ribonucléotides incorporés par erreur dans l’ADN génomique et qui traite les hybrides ARN:ADN. Cette activité soutient la réparation par excision des ribonucléotides, préserve l’intégrité de la fourche de réplication et limite la signalisation des dommages à l’ADN associés à la réplication. La fonction de RNASEH2A est étroitement liée aux voies de maintien du génome, notamment la réplication de l’ADN, le contrôle du point de contrôle de la phase S et la résolution du stress associé aux R-loops. La dérégulation de l’activité de RNase H2 a été associée à des phénotypes inflammatoires et d’instabilité génomique, faisant de RNASEH2A un nœud d’intérêt pour étudier le métabolisme des acides nucléiques et les réponses aux dommages de l’ADN.

RNase HII-A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNASEH2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNase HII-A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNASEH2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNASEH2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNase HII-A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNASEH2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNase HII-A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNase HII-A dans les cellules tumorales présentant une expression de RNASEH2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.