RNase H1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402850-ACT

Das humane RNASEH1-Gen kodiert RNase H1, eine nukleäre und mitochondriale Endonuklease, die gezielt den RNA-Strang von RNA:DNA-Hybriden abbaut und so die Entfernung von R-Loops während Transkription und Replikation unterstützt. Durch die Prozessierung von RNA-Primern und die Auflösung hybrider Zwischenprodukte trägt RNase H1 zur Genomstabilität, zur Replikation und Reparatur der mitochondrialen DNA sowie zur Koordination von Replikations–Transkriptions-Konflikten bei. Eine dysregulierte Umsetzung (Turnover) von RNA:DNA-Hybriden wird mit Replikationsstress und DNA-Schadenssignalgebung in Verbindung gebracht, wodurch RNASEH1 einen relevanten Knotenpunkt für die Untersuchung von Signalwegen darstellt, die den Nukleinsäurestoffwechsel mit zellulären Stressantworten koppeln. Eine veränderte RNase-H1-Funktion ist zudem mit Phänotypen mitochondrialer Dysfunktion assoziiert und ermöglicht mechanistische Untersuchungen der Erhaltung des mitochondrialen Genoms in krankheitsrelevanten Kontexten.

RNase H1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RNASEH1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RNase H1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RNASEH1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RNASEH1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RNase H1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RNASEH1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RNase H1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RNase H1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RNASEH1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.