RISC CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406937-ACT

Das humane SCPEP1 (Serin-Carboxypeptidase 1) kodiert ein sezerniertes/extrazelluläres, serin-carboxypeptidase-ähnliches Protein, das an der proteolytischen Prozessierung und am Umbau des perizellulären Mikroumfelds beteiligt ist. SCPEP1 wurde mit zellulären Programmen der Gefäßbiologie in Verbindung gebracht, darunter die Modulation des Phänotyps glatter Muskelzellen, Migration sowie Reaktionen auf entzündliche Signale, die mit dem Turnover der extrazellulären Matrix und der Wachstumsfaktor-Signalgebung verknüpft sind. Eine veränderte SCPEP1-Expression wurde in Zusammenhängen des vaskulären Remodellings und von für kardiometabolische Erkrankungen relevanten Prozessen beschrieben, was seinen Einsatz als mechanistischer Knotenpunkt in Studien zu atheroskleroseassoziierten Signalwegen unterstützt. Als Bestandteil sezernierter Proteasenetzwerke ist SCPEP1 zudem interessant, um zu untersuchen, wie extrazelluläre Proteolyse die Zell-Zell-Kommunikation und die Gewebehomöostase beeinflusst.

RISC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SCPEP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RISC Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SCPEP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SCPEP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RISC-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SCPEP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RISC-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RISC-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SCPEP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.