RICK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400731-ACT

Die rezeptorinteragierende Serin/Threonin-Proteinkinase 2 (RIPK2; auch als RICK bekannt) ist eine zytosolische Signal-Kinase, die als zentraler Adapter nachgeschaltet zu den Mustererkennungsrezeptoren NOD1 und NOD2 fungiert. Nach Erkennung bakterieller Peptidoglykan-Motive vermittelt RIPK2 ubiquitinabhängige Signalübertragung zur Aktivierung der NF-κB- und MAPK-Signalwege und prägt dadurch die Expression inflammatorischer Gene, die Zytokinproduktion sowie die angeborene Immun-Interaktion mit epithelialen und myeloiden Zellen. RIPK2 ist außerdem mit Autophagie- und Zellstress-Signalwegen verknüpft, unter anderem über die Regulation von Ubiquitin-Ligasen und nachgeschalteten Kinasekaskaden. Eine dysregulierte Aktivität des RIPK2-Signalwegs wurde mit chronisch-inflammatorischen Phänotypen und immunvermittelter Pathologie in Verbindung gebracht, weshalb RIPK2 ein breit untersuchter Knotenpunkt in der Forschung zu Wirt–Mikroben-Interaktionen und inflammatorischer Signalübertragung ist.

RICK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RIPK2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RICK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RIPK2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RIPK2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RICK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RIPK2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RICK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RICK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RIPK2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.