RIC-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405366-ACT

Humanes RIC3 kodiert RIC-3, ein im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiertes Chaperon, das die Faltung, den Zusammenbau und den Transport ausgewählter ligandengesteuerter Ionenkanäle fördert, insbesondere nikotinischer Acetylcholinrezeptoren. Durch die Kontrolle der Rezeptorreifung und der Oberflächenexpression beeinflusst RIC-3 die cholinerge synaptische Transmission, die neuronale Erregbarkeit und nachgeschaltete calciumabhängige Signalprogramme. Eine veränderte Regulation der Biogenese nikotinischer Rezeptoren und der Funktion cholinerger Netzwerke wurde mit neurologischen und neuropsychiatrischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was RIC3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der Proteostase von Rezeptoren und der synaptischen Signalübertragung macht. RIC-3 wird zudem als mechanistischer Ansatz genutzt, um die ER-Qualitätskontrolle, die Stöchiometrie von Kanalkomplexen und reizabhängige Veränderungen der Rezeptorverfügbarkeit zu analysieren.

RIC-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RIC3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RIC-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RIC3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RIC3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RIC-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RIC3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RIC-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RIC-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RIC3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.