Rfp2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403870-ACT

TRIM13 (Rfp2) ist eine humane RING-Finger-E3-Ubiquitin-Ligase, die im endoplasmatischen Retikulum angereichert ist. Dort reguliert sie die Protein-Homöostase, indem sie die Ubiquitinierung katalysiert und Substrate dem proteasomalen Abbau zuführt. Sie ist an der ER-assoziierten Degradation sowie an der übergeordneten Kontrolle des Ubiquitin–Proteasom-Systems beteiligt und beeinflusst zelluläre Reaktionen auf fehlgefaltete Proteine, oxidativen Stress und Apoptose. Durch die Modulation von Signalkomponenten und Qualitätskontrollwegen kann Rfp2 Entzündungs- und Überlebensprogramme beeinflussen, die Entscheidungen über das Zellschicksal prägen. Veränderte TRIM13-Expression oder -Aktivität wurde in Studien zur Krebsbiologie und zu proteostatischen Ungleichgewichten bei Neurodegeneration beschrieben, was seine Relevanz als Knotenpunkt unterstreicht, der ER-Stress und Ubiquitin-Signalgebung verbindet.

Rfp2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRIM13-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rfp2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRIM13-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRIM13-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rfp2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRIM13-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rfp2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rfp2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRIM13-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.