REV1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402251-ACT

Humanes REV1 kodiert eine DNA-Polymerase der Y-Familie, die bei der DNA-Schadentoleranz sowohl als Gerüstprotein als auch als spezialisierte Translesionssynthese-(TLS)-Polymerase fungiert. REV1 koordiniert die Nukleotid-Insertion gegenüber geschädigten Basen und rekrutiert über Interaktionen mit REV7/MAD2L2 und weiteren TLS-Faktoren die Polymerase ζ, wodurch Replikationsgabeln sperrige DNA-Addukte umgehen können. Diese Aktivität ist in Antworten auf Replikationsstress, Post-Replikations-Reparatur und Signalwege zur Aufrechterhaltung der Genomstabilität eingebunden; ein verändertes TLS-Gleichgewicht kann dabei Mutagenese und die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber genotoxischem Stress beeinflussen. REV1 wird daher intensiv im Kontext von DNA-Reparaturmechanismen, Replikationstreue und der für die Krebsbiologie sowie andere mit Genominstabilität assoziierte Erkrankungen relevanten Mutationsakkumulation untersucht.

REV1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen REV1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

REV1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des REV1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der REV1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen REV1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native REV1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von REV1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des REV1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem REV1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.