Rev-erbα CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401211-ACT

NR1D1 kodiert den nukleären Rezeptor Rev-erbα, einen häm-bindenden Transkriptionsrepressor, der die zirkadiane Uhr mit metabolischen und entzündungsbezogenen Genprogrammen verknüpft. Rev-erbα reguliert zentrale Komponenten der Uhr sowie Transkriptionsnetzwerke, die über Interaktionen mit Korepressoren wie NCoR/HDAC3 die Lipid- und Glukosehomöostase, die mitochondriale Funktion und die Polarisierung von Makrophagen steuern. Seine Aktivität integriert Signale aus zirkadianem Rhythmus, nukleärer Rezeptorsignalgebung und energie-sensitiven Signalwegen und prägt so die gewebespezifische zeitliche Abstimmung der Genexpression. Eine Fehlregulation von NR1D1 wird mit veränderter zirkadianer Physiologie in Verbindung gebracht und wurde u. a. in Kontexten wie metabolischer Dysfunktion, immunvermittelter Entzündung und krebsassoziiertem transkriptionellem Rewiring untersucht.

Rev-erbα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NR1D1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rev-erbα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NR1D1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NR1D1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rev-erbα-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NR1D1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rev-erbα-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rev-erbα-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NR1D1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.