REP-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404025-ACT

CHM kodiert das Rab-Escort-Protein 1 (REP-1), ein zytosolisches Chaperon, das für die posttranslationale Geranylgeranylierung von Rab-GTPasen essenziell ist, indem es neu synthetisierte Rab-Proteine der Rab-Geranylgeranyltransferase (GGTase II) präsentiert. Diese Modifikation ist für die Membranassoziation von Rab erforderlich und steuert den vesikulären Transport, die Endosom–Lysosom-Dynamik sowie die regulierte Sekretion in zahlreichen Zelltypen, einschließlich des retinalen Pigmentepithels. Eine Störung der REP-1-Funktion beeinträchtigt die Rab-Prenylierung und den intrazellulären Transport – Prozesse, die eng mit der Homöostase von Photorezeptoren und RPE verknüpft sind. Ein CHM-Mangel ist mit Choroideremie assoziiert, wodurch REP-1 ein relevanter Ansatzpunkt für mechanistische Studien zu Stress in Membrantransportwegen und degenerationsassoziierten zellulären Phänotypen ist.

REP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

REP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen REP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von REP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des REP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.