Rent1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402462-ACT

Humanes UPF1 (Rent1) ist eine ATP-abhängige RNA-Helikase und zentraler Effektor des nonsense-vermittelten mRNA-Abbaus (NMD), eines konservierten Signalwegs, der Transkripte mit vorzeitigen Terminationscodons erkennt und abbaut. Über Interaktionen mit SMG-Proteinen und dem Exon-Junction-Komplex koppelt UPF1 die Überwachung der Translationsbeendigung an mRNP-Remodeling, RNA-Qualitätskontrolle und die Regulation normaler Transkriptisoformen. Über NMD hinaus trägt UPF1 zur Telomererhaltung, Genomstabilität und stressresponsiven RNA-Metabolismus bei und verknüpft damit RNA-Überwachung mit einer umfassenderen zellulären Homöostase. Eine fehlregulierte UPF1-Aktivität wurde mit einer veränderten Integrität des Transkriptoms und einer aberranten Proteomzusammensetzung in Zusammenhängen wie Tumorentstehung und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Eignung für mechanistische Studien der RNA-Regulation unterstreicht.

Rent1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UPF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rent1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UPF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UPF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rent1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UPF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rent1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rent1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UPF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.