Ref-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400932-ACT

APEX1 kodiert Ref-1 (APE1), eine essentielle apurinische/apyrimidinische Endonuklease, die die Basenexzisionsreparatur koordiniert, indem sie abasische DNA-Stellen spaltet, die nach oxidativen Schäden, Alkylierung oder spontanem Basenverlust entstehen. Über die DNA-Reparatur hinaus fungiert Ref-1 auch als Redox-Regulator, der die DNA-Bindungsaktivität von Transkriptionsfaktoren moduliert, die an Stress- und Entzündungssignalwegen beteiligt sind, darunter AP-1, NF-κB und HIF-1. Durch diese Funktionen unterstützt APEX1 die Genomstabilität, die Toleranz gegenüber replikationsassoziierten Schäden und zelluläre Antworten auf reaktive Sauerstoffspezies. Eine fehlregulierte APEX1-Aktivität und ein verändertes Redox-/Reparaturgleichgewicht wurden mit Tumorbiologie, Neurodegeneration und entzündlichen Pathologien in Verbindung gebracht und machen APEX1 zu einem zentralen Knotenpunkt für mechanistische Untersuchungen von DNA-Schadensantworten.

Ref-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen APEX1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ref-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des APEX1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der APEX1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ref-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native APEX1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ref-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ref-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem APEX1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.