Plásmido CRISPR de Activación (h) Ref-1: sc-400932-ACT

APEX1 codifica Ref-1 (APE1), una endonucleasa apurínica/apirimidínica esencial que coordina la reparación por escisión de bases al cortar sitios abásicos del ADN generados tras daño oxidativo, alquilación o pérdida espontánea de bases. Más allá de la reparación del ADN, Ref-1 también actúa como regulador redox que modula la actividad de unión al ADN de factores de transcripción implicados en la señalización de estrés e inflamación, incluidos AP-1, NF-κB y HIF-1. A través de estas funciones, APEX1 contribuye a la estabilidad del genoma, a la tolerancia al daño asociado a la replicación y a las respuestas celulares a las especies reactivas de oxígeno. La actividad desregulada de APEX1 y un equilibrio redox/reparación alterado se han asociado con la biología tumoral, la neurodegeneración y patologías inflamatorias, lo que lo convierte en un nodo clave para estudios mecanísticos de las respuestas al daño del ADN.

Ref-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de APEX1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Ref-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus APEX1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional APEX1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Ref-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo APEX1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Ref-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Ref-1 en células tumorales con expresión de APEX1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.